Tahapan Tehnik Kultur Jaringan
Kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti sekelompok sel atau jaringan yang ditumbuhkan dalam kondisi aseptik, sehingga bagian tanaman tersebut bisa dapat memperbanyak diri hingga tumbuh menjadi tanaman-tanaman yang baru kembali dengan sifat yang sama.
Pembuatan Media
Media tanam kultur jaringan merupakan media yang diperlukan agar sel atau jaringan tanaman yang diisolasi dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman yang lengkap. Media tersebut mempunyai komposisi nutrien yang dapat mendukung pertumbuhan eksplan sesuai dengan yang diinginkan. Kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan bahan tanam/eksplan yang optimal sangat bervariasi antar jenis tanaman, bahkan di antara bagian tanaman yang berbeda.
Komposisi media tanam kultur jaringan terdiri dari sejumlah unsur yang diperlukan untuk pertumbuhan bahan tanam/eksplan dalam lingkungan buatan, dengan pengelompokan sebagai berikut :
1. Hara Makro (Macro Nutrient).
Hara makro adalah unsur hara esensial yang dibutuhkan dalam jumlah banyak oleh tanaman, yaitu nitrogen (N), phosfor (P), kalium (K), kalsium (Ca), magnesium (Mg), dan sulfur (S). N merupakan komponen dalam pembentukan protein dan asam amino dalam tubuh tanaman, juga merupakan elemen pada beberapa koenzim. P merupakan komponen pembentukan asam nukleat (DNA dan RNA) serta dibutuhkan sebagai sumber energi transfer. K dibutuhkan untuk mengatur potensial osmotik sel tanaman. Ca untuk sintesis dinding sel, fungsi membran dan berperan dalam aktifnya signal sel. Mg merupakan kofaktor enzim dan komponen klorofil. S adalah komponen beberapa asam amino dan beberapa kofaktor enzim. Media makro pada MS terdiri dari KNO3, NH4NO3, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, dan KH2PO4.
2. Hara Mikro (Micro Nutrient).
Hara mikro adalah unsur hara esensial yang dibutuhkan dalam jumlah sedikit oleh tanaman, yaitu ferum/zat besi(Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), cobalt (Co), copper (Cu) dan molybdenum (Mo). Fe merupakan komponen cytochrome yang berperan dalam transfer electron. Mn adalah kofaktor enzim, Zn berperan dalam sintesis klorofil dan juga merupakan kofaktor enzim. Co adalah komponen beberapa vitamin. Cu merupakan kofaktor enzim dan berperan dalam reaksi transfer elektron. Mo juga merupakan kofaktor enzim dan komponen dari enzim nitrate reductase. Baik hara makro maupun hara mikro, keduanya diberikan dalam bentuk garam inorganik.
3. Myo-inositol
Myo-inositol adalah senyawa golongan karbohidrat yang ditambahkan pada media kultur dalam jumlah sedikit untuk menstimulasi pertumbuhan sel pada banyak spesies tanaman. Meskipun bukan tergolong vitamin, namun senyawa ini akan terpecah menjadi vitamin C dan pectin. Myo-inositol memiliki peran dalam pembelahan sel, digunakan dalam konsentrasi berkisar 50-5000 ppm.
4. Zat pengatur tumbuh.
Umumnya ada dua golongan zat pengatur tumbuh (ZPT) yang digunakan dalam kultur in-vitro, yakni golongan auksin dan sitokinin. ZPT golongan auksin yang biasa digunakan dalam kultur in-vitro adalah: indole-3- acetic acid (IAA), indole-3- butricacide (IBA), 2,4-dichlorophenoxy-acetic acid (2,4-D) dan naphthalene- acetic acid (NAA). ZPT dari golongan sitokinin adalah: BA (Benzyladenine), BAP (6-benzyloaminopurine), 2- iP (isopentenyl adenine), kinetin (6-furfurylaminopurine), Zeatin (6-4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine) dan TDZ (thidiazuron). Rasio kedua golongan ZPT ini akan mempengaruhi arah morfogenesis yang terjadi pada kultur. Rasio auksin yang lebih tinggi dari sitokinin akan menstimulasi terbentuknya akar, sedangkan rasio sitokinin yang lebih tinggi dari auksin akan menginduksi terbentuknya tunas. Jika auksin dan sitokinin pada konsentrasi yang sama (rasio 1) maka akan terbentuk kalus. Untuk pembentukan kalus juga dapat digunakan 2,4-D. Ada beberapa jenis ZPT lainnya yang digunakan dalam kultur in vitro. ZPT tersebut yaitu gibberellin (GA3) untuk pembentukan tunas pada spesies tertentu, dan asam absisik (ABA) untuk pematangan embrio pada proses embriogenesis somatik. Dalam proses pembuatan larutan stok ZPT, untuk IAA, 2,4-D dan NAA dapat dilarutkan awal dengan beberapa tetes alkohol 95% atau NaOH 1N, sedangkan untuk golongan sitokinin umumnya digunakan beberapa tetes HCL 1N atau dimethylsulfoxide (DMSO). Jika bahan sudah terlarut oleh pelarut awal, maka baru kemudian ditambah DD water (Double distilled water) untuk mencapai volume yang diinginkan. Penggunaan pelarut awal ini diperlukan untuk menghindari terjadinya penggumpalan akibat tidak larutnya ZPT tersebut.
5. Vitamin
Vitamin dibutuhkan tanaman sebagai katalisator dalam berbagai proses metabolisme. Vitamin digunakan untuk pertumbuhan sel serta proses diferensiasi sel dan jaringan yang ditanam secara in vitro. Beberapa jenis vitamin yang digunakan dalam kultur in vitro adalah thiamin, nicotinic acid dan pyridoxine. Diantara ketiganya, yang bersifat esensial adalah thiamin (vitamin B1) yang dibutuhkan untuk pertumbuhan sel tanaman. Nicotinic acid dan pyridoxine (vitamin B6) dibutuhkan hanya oleh spesies tanaman tertentu. Ada beberapa jenis vitamin lainnya yang digunakan dalam kultur in vitro namun bersifat tidak umum atau spesifik hanya untuk kultur tertentu, yakni biotin, folic acid, ascorbic acid, pantothenic acid, tocopherol (vitamin E), riboflavin, dan p-amino- benzoic acid.
6. Gula
Jenis gula yang umum digunakan dalam kultur in vitro adalah sukrosa, jumlahnya berkisar 2-3 % atau 20-30 gram/liter media. Selain sukrosa, beberapa jenis gula lainnya adalah laktosa, galaktosa, maltosa , glukosa dan fruktosa. Gula diberikan pada media kultur sebagai sumber karbohidrat untuk respirasi karena tanaman kultur bersifat heterotroph, tidak dapat melakukan fotosintesis untuk menghasilkan karbohidrat. Respirasi menghasilkan energi yang digunakan oleh sel tanaman untuk melakukan pembelahan sel. Dengan demikian gula ditambahkan pada media kultur sebagai sumber energi.
7. Asam amino
Asam amino tidak selalu harus ditambahkan pada media kultur, namun diperlukan untuk kultur sel dan kultur protoplas. Penggunaannya secara tunggal atau campuran dari beberapa asam amino. Asam amino menyediakan sumber nitrogen untuk pertumbuhan sel. Senyawa nitrogen ini lebih mudah diserap oleh sel tanaman dibandingkan sumber nitrogen dari garam inorganik. Asam amino yang biasa digunakan adalah casein hydrolysate, L- glutamine, L-asparagine, adenine, glycine, glutamine, asparagine, L-arginine, cysteine dan L-tyrosine.
8. Pemadat media
Penambahan senyawa pemadat bertujuan untuk membuat media menjadi padat maupun semi padat. Pemadat tersebut dapat berupa agar, agarose atau gellan gum. Agar dan agarose digunakan dalam konsentrasi 0.7-1.0% (7-10 gram per-liter media), sedangkan gellan gum 0.2-0.6% (2-6 gram per-liter media). Gellan gum dijual dengan nama dagang Gellrite, Phytagel dan Kelcogel. Media kultur sebaiknya tidak terlalu padat agar penyerapan nutrisi dapat berjalan baik.
Teknik Pembuatan Media Kultur
Kebutuhan media dan larutan stok diartikan sebagai kebutuhan akan jumlah bahan media dan larutan stok yang harus dipenuhi pada waktu yang diperlukan pada beberapa macam/tahap kegiatan kultur jaringan. Kebutuhan media ini dapat dibedakan atas kebutuhan per kegiatan kultur jaringan per satuan waktu tertentu dan kebutuhan untuk total kegiatan kultur jaringan per satuan waktu tertentu.
Kebutuhan media ini secara rinci dihitung berdasarkan tahapan- tahapan pekerjaan yang berkaitan dengan pemakaian media, yaitu: tahap inisiasi kultur (penumbuhan awal eksplan), tahap penggandaan propagul (tergantung frekuensi penggandaan), tahap pembesaran kultur sampai planlet siap diaklimatisasikan.
Pencampuran Bahan Media Kultur
Cara mencampur bahan media untuk pembuatan media 1 liter adalah sebagai berikut : masukkan ke dalam erlenmeyer berukuran 1 liter aquades kira-kira 300 ml, larutkan gula diikuti mio-inositol kedalamnya setelah gula larut sempurna dengan diaduk secara merata. Larutan-larutan stok dimasukkan satu per satu, setelah satu bahan melarut diikuti bahan yang lainnya.. Hasil pencampuran media dituangkan dari erlenmeyer ke labu takar atau gelas ukur untuk ditepatkan volumenya menjadi 1 liter, dengan menambah aquades.
Pengaturan pH Media Kultur
Kisaran nilai pH yang dipandang paling sesuai untuk kebanyakan media kultur jaringan untuk mendukung pertumbuhan dan perkembangan sel-sel tanaman antara 5,6-5,8. Pada nilai pH yang terlalu asam (< 4,5) agar akan terhidrolisis dan sulit membentuk gel. Nilai pH harus diatur agar tidak mengganggu membran sel dan pH sitoplasma.
Pemasakan Bahan Media Kultur
Media dalam panci dimasak pada kompor sambil diaduk-aduk menggunakan pengaduk pada pemanas kompor. Setelah mendekati keadaan mendidih (sudah mulai keluar titik-titik gelembung sebelum menjadi gelembung besar), pemanasan dihentikan.
Sterilisasi Bahan Media Kultur
Setelah pembuatan media agar selesai, media dibagi-bagi ke dalam botol-botol penanaman, dalam satu botol tanam berisi kurang lebih 20-25 ml. Selama proses pemindahan media ke dalam botol-botol penanaman sangat memungkinkan terjadinya kontaminasi oleh mikroorganisme, baik bakteri atau jamur. Agar mikroorganisme yang masuk ke dalam media tidak dapat berkembang biak maka perlu dilakukan sterilisasi terhadap media tersebut sebelum digunakan untuk menanam. Sterilisasi media kultur bisa dilakukan dengan menggunakan uap panas pada suhu 121o C, dengan tekanan 15-17 psi, selama 20-30 menit. Alat yang dIgunakan untuk sterilisasi adalah autoclave. Sterilisasi media tidak boleh terlalu lama karena bisa menyebabkan penguraian gula, degradasi vitamin dan asam-asam amino, inaktivasi sitokinin dan zeatine ribosida dan perubahan pH media. Media yang sudah disterilkan bisa disimpan terlebih dahulu pada ruang penyimpanan. Setelah minimal 3 hari disimpan dan media aman dari kontaminan, media kultur siap digunakan untuk menanam.
2. Inisiasin
Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas. Eksplan dapat berasal dari : daun, tunas, cabang, batang, akar, embrio, kotiledon, hipokotil, epikotil
Proses Inisiasi
3.Sterilisasi
Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril.
4. Multiplikasi
Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang telah ditanami eksplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar.
5. Pengakaran
Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan oleh jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).
6. Aklimatisasi
Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptik ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif.
Proses Aklimatisasi
Agar anda lebih memahami tahapan kultur jaringan, marilah kita pelajari konsep penting di bawah ini!
Konsep penting
Istilah-istilah dalam kultur jaringan
Aseptik : menumbuhkan jaringan tanaman pada kondisi bebas kontaminasi mikroba
Desinfektan : proses menghilangkan kontaminan permukaan eksplan yang kemungkinan dapat tumbuh di lingkungan kultur jaringan dan berakibat mematikan eksplan
In vitro : kultur organ atau sel pada medium pertumbuhan yang mengandung nutrisi, di dalam suatu wadah terbuat dari kaca/gelas (erlenmeyer, botol kaca dsb) & dalam kondisi lingkungan yg terkontrol
Ex vitro : menumbuhkan di luar wadah kaca, pada lingkungan yang terkendali
Eksplan : bagian dari tanaman yang akan dikultur pada proses mikropropagasi atau kultur jaringan
Kalus : Eksplan akan terus membelah membentuk masa sel yang belum terdifferensiasi
Planlet : tanaman kecil hasil pertumbuhan kalus yang sudah terdifferensiasi
Comments
Post a Comment